laporan praktikum kadar protein analisis protein

I.       JUDUL

Praktikum Penentuan Kadar Protein pada Kedelai

II.      Tujuan

Mahasiswa diharapkan mampu untuk menganalisis kadar protein dalam suatu bahan dengan menggunakan N secara gunning.

III.   Dasar Teori

Oleh adanya kedua gugus tersebut asam amino dalam larutan dapat membentuk ion yang bermuatan positif dan juga bermuatan protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).

Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).

Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:

                                                           H

H2N                C              COOH

                                                           R

                                                                                                (Lehninger, 1995).

Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksilat akan melepaskan ion H⁺, sedangkan gugus amina akan menerima ion H⁺, seperti reaksi berikut:

negatif atau disebut juga ion amfoter (zwitterion). Keadaan ion ini sangat tergantung pada pH larutan. Apabila asam amino dalam air ditambah dengan basa, maka asam amino akan terdapat dalam bentuk (I) karena konsentrasi ion OH^- yang tinggi mampu mengikat ion-ion H⁺ pada gugus –NH₃⁺. Sebaliknya bila ditambahkan asam ke dalam larutan asam amino, maka konsentrasi ion H⁺ yang tinggi mampu berikatan dengan ion –COO^- sehingga terbentuk gugus –COOH sehingga asam amino akan terdapat dalam bentuk (II).

Dalam suatu sistem elektroforesis yang memiliki elektroda positif dan negatif, asam amino akan bergerak menuju elektroda yang berlawanan dengan muatan asam amino yang terdapat dalam larutan. Apabila ion asam amino tidak bergerak ke arah negatif maupun positif  dalam suatu sistem elektroforesis maka pH pada saat itu disebut pH isolistrik. Pada pH tersebut terdapat keseimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion dan kation.

Gugus karboksil pada asam amino dapat dilepas dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen yang dapat diukur volumenya. Van Slyke menggunakan reaksi ini untuk menentukan gugus amino bebas pada asam amino, peptida maupun protein.

Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena gugus –COOH dan –NH₂ membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih lanjut akan dihasilkan asam-asam amino.

Sifat peptida ditentukan oleh gugus –COOH, –NH₂ dan gugus R. Sifat asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus –COOH dan –NH₂ , namun pada rantai panjang gugus –COOH dan –NH₂  yang terletak diujung rantai tidak lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein.

Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk; primer, sekunder, tersier dan kuartener. Susunan linier asam amino dalam protein merupakan struktur primer. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur sekunder serta tersier. Bila protein menandung banyak asam amino dengan gugus hidrofobik, daya kelarutannya kurang dalam air dibandingkan dengan protein yang banyak mengandung asam amino dengan gugus hidrofil. (Winarno, 1992).

Protein yang terdapat dalam bahan pangan mudah mengalami perubahan-perubahan, antara lain:

1.    Dapat terdenaturasi oleh perlakuan pemanasan.

2.    Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh perlakuan pengasaman.

3.    Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim-enzim proteolitik.

4.    Dapat bereaksi dengan gula reduksi, sehingga menyebabkan terjadinya warna coklat.

Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhdap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan atau wiru molekul protein.

Denaturasi karena Panas:

Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemasakan.  

Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit (Ophart, C.E., 2003).

Protein yang mudah dicerna menunjukkan tingginya jumlah asam-asam amino yang dapat diserap oleh tubuh dan begitu juga sebaliknya. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi daya cerna protein dalam tubuh adalah kondisi fisik dan kimia bahan. Makin keras bahan, maka akan menurunkan daya cernanya dalam tubuh karena adanya ikatan kompleks yang terdapat di dalam bahan yang sifatnya semakin kuat. Ikatan ini dapat berupa ikatan antar molekul protein, ikatan protein- fitat, dan sebaginya. Sedangkan kondisi kimia yaitu adanya senyawa anti gizi seperti tripsin inhibitor dan fitat (Muchtadi, 1989).

Peneraan jumlah protein dilakukan dengan menentukan jumlah nitrogen yang dikandung oleh suatu bahan. N total bahan diukur dengan menggunakan metode mikro-Kjeldahl. Prinsip dari metode ini adalah oksidasi senyawa organik oleh asam sulfat untuk membentuk CO₂ dan H₂O serta pelepasan nitrogen dalam bentuk ammonia yaitu penentuan protein berdasarkan jumlah N. Dalam penentuan protein seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan. Akan tetapi teknik ini sulit sekali dilakukan mengingat kandungan senyawaan N lain selain protein dalam bahan juga terikut dalam analisis ini. Jumlah senyawaan N ini biasanya sangat kecil yang meliputi urea, asam nukleat, ammonia, nitrat, nitrit, asam amino, amida, purin, dan pirimidin. Oleh karena itu penentuan jumlah N total ini tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Kadar protein yang ditentukan dengan cara ini  biasa disebut sebagai protein kadar/crude protein (Sudarmadji, 1996).

Analisa protein cara kjeldahl pada dasarnya dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses :

1.      Destruksi

Dengan menambahkan asam sulfat pekat, nitrogen dilepaskan dari molekul protein dan terkonversi menjadi garam amonium sulfat, denngan reaksi seperi pada persamaan berikut:

N dalam protein + H₂SO₄                    (NH₄)₂ SO₄

2.     Distilasi

Distilasi bertujuan untuk melepaskan nitrogen dari cairan hasil destruksi. Selama nitrogen masih terikat sebagai garam ammonium, hanya air yang akan teruapkan selama distilasi. Untuk melepaskan nitrogen dari cairan hasil destruksi, ion NH₄⁺ diubah menjadi NH₃. Agar NH₄⁺ berubah menjadi NH_3, konsentrasi OH^- dalam sistem larutan teersebut harus tinggi. Hal tersebut dapat dicapai dengan menambahkan basa kedalam sistem larutan. Selanjutnya setelah nitrogen terikat sebagai NH₃ yang terlepas ditangkap dalam larutan asam yang telah diketahui normalitasnya.

3.        Titrasi

Amoniak (NH) yang dilepaskan selama proses distilasi akan bereaksi dengan asam membentuk garam amonium. Dengan menggunakan metode titrasi alkalimetri, dapat ditentukan jumlah asam yang masih tersisa dalam larutan penangkapnya. Setelah kadar N total diketahui dari analisis gunning, maka untuk menentukan kadar protein diperlukan faktor konversi yang menghubungkan berat protein dengan berat N total dalam bahan seperti persamaan sebagai berikut :

(Berat protein) = (faktor konversi) x (berat N)

Kedelai dikenal dengan berbagai nama: sojaboom, soja, soja bohne, soybean, kedele, kacang ramang, kacang bulu, kacang gimbol, retak mejong, kaceng bulu, kacang jepun, dekenana, demekun, dele, kadele, kadang jepun, lebui bawak, lawui, sarupapa tiak, dole, kadule, puwe mon, kacang kuning (aceh) dan gadelei. Berbagai nama ini menunjukkan bahwa kedelai telah lama dikenal di Indonesia.

Kedelai merupakan terna dikotil semusim dengan percabangan sedikit, sistem perakaran akar tunggang, dan batang berkambium. Kedelai dapat berubah penampilan menjadi tumbuhan setengah merambat dalam keadaan pencahayaan rendah. Kedelai, khususnya kedelai putih dari daerah subtropik, juga merupakan tanaman hari-pendek dengan waktu kritis rata-rata 13 jam. Ia akan segera berbunga apabila pada masa siap berbunga panjang hari kurang dari 13 jam. Ini menjelaskan rendahnya produksi di daerah tropika, karena tanaman terlalu dini berbunga.

Di Indonesia, kedelai menjadi sumber gizi protein nabati utama, meskipun Indonesia harus mengimpor sebagian besar kebutuhan kedelai. Ini terjadi karena kebutuhan Indonesia yang tinggi akan kedelai putih. Kedelai putih bukan asli tanaman tropis sehingga hasilnya selalu lebih rendah daripada di Jepang dan Cina. Pemuliaan serta domestikasi belum berhasil sepenuhnya mengubah sifat fotosensitif kedelai putih. Di sisi lain, kedelai hitam yang tidak fotosensitif kurang mendapat perhatian dalam pemuliaan meskipun dari segi adaptasi lebih cocok bagi Indonesia.

Berbicara mengenai mutu protein suatu bahan pangan, pertama-tama yang harus dilihat adalah kadarnya, kemudian susunan asam-asam amino esensialnya dan daya cernanya. Kedelai mengandung kadar protein yang tinggi, yaitu sekitar 30-40%, dan dibandingkan dengan protein hewani (telur) protein kacang kedelai kekurangan asam amino belerang. Mutu gizi suatu protein sangat ditentukan oleh asam amino yang kurang tersebut. Karena walaupun asam amino lainnya berlebihan, tidak dapat digunakan untuk sintesa protein tubuh tetapi akan dibakar oleh tubuh sebagai sumber kalori. (http://web.ipb.ac.id/~tpg/de/pubde_ntrtnhlth_kdlaiprotein.php).

Kedelai merupakan tumbuhan serbaguna. Karena akarnya memiliki bintil pengikat nitrogen bebas, kedelai merupakan tanaman dengan kadar protein tinggi sehingga tanamannya digunakan sebagai pupuk hijau dan pakan ternak.

Pemanfaatan utama kedelai adalah dari biji. Biji kedelai kaya protein dan lemak serta beberapa bahan gizi penting lain, misalnya vitamin (asam fitat) dan lesitin. Olahan biji dapat dibuat menjadi :

·       Tahu (tofu),

• Bermacam-macam saus penyedap (salah satunya kecap, yang aslinya dibuat dari kedelai hitam),

·       Tempe

·       Susu kedelai (baik bagi orang yang sensitif laktosa),

·       Tepung kedelai,

·       Minyak (dari sini dapat dibuat sabun, plastik, kosmetik, resin, tinta, krayon, pelarut, dan biodiesel.

·       Taosi

·       Tauco

IV.             Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Praktikum

Tabel I. Alat yang dibutuhkan untuk analisis protein

Proses	Jenis Alat	Spesfikasi	Jumlah
Destruksi	Labu kjehdahl Kompor listrik Pipet volum Pipet ukur	500 ml 25 ml 10 ml	1 buah 1 buah 1 buah 1 buah
Destilasi	Pemanas mantel Labu kjehdahl Bola kaca Pendingin balik Adapter Gelas beker Ember plastik	500 ml 200 ml	1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah
Titrasi	Buret Erlenmeyer Statik	50 ml 250 ml	1 buah 1 buah 1 buah

     Tabel II. Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam percobaan

                                     

Bahan	Jumlah
1. Bahan yang dianalisis 2. K2SO4 3. CuSO4 4. H2SO4 pekat 5. Akuades 6. Logam Zn 7. Indilator 8. Larutan NaOH (45 %) 9. Larutan NaOH (0,1 %) 10. Indikator metil merah 11. Larutan HCl	1,5 gr 10 gr 0,3 gr 35 ml 200 ml 2 butir 5 tetes 100 ml 75 ml 5 tetes 75 ml

  

  

  

V.      Prosedur Kerja

Analisis N dengan cara Gunning dilakukan dengan prosedur ssebagai berikut:

a.     Destruksi

1.   Ambil kedelai, menimbang sebanyak 1,5002 masukkan kedalam botol timbang.

2.   Ambil  K₂SO₄ ditimbang menggunakan gelas arloji sebanyak 10,0027 gr, dan  CuSO₄  sebanyak 0,2501 gr, masukkan kedalam labu kjeldahl dan bersihkan.

3.   Kemudian masukkan kedelai yang telah dihaluskan kedalam labu kjeldahl dimasukan kedalam lemari asam memasangkan  pada statif.

4.   Tambahkan H₂SO₄ dan kemudian panaskan dengan pemanas mantel.

5.   Pemanas dilakukan sampai kabut dalam labu hilang dan cairan menjadi jernih.

6.   Menghitung waktu yang dibutuhkan seberapa lama.

7.   Selanjutnya labu didinginkan diudara terbuka

                     b.    Distilasi

1.   Pada labu kjeldahl hasil reaksi ditambahkan 2 butir Zn, 100 ml akuades dan indikator PP sebanyak 5 tetes.

2.   Setelah itu labu dicelupkan kedalam ember berisi air dan pecahan es sambil digoyang-goyang.

3.   Selanjutnya larutan NaOH dituangkan kedalam labu sedikit demi sedikit penambahan NaOH sampai cairan bersifat basa, hal ini ditandai dengan berubahnya warna cairan menjadi unggu kebiru-biruan.

4.   Labu segera dihubungkan dengan rangkaian alat distilasi seperti gambar. Ujung pendingin dihubungkan dengan adapter yang tercelup kedalam larutan penangkap yaitu 75 ml larutan HCl 0,1 N yang berisi 4 tetes indikator metil jingga.

5.   Sesudah terjadi bunyi hentakan dari dalam labu, distilasi dihentikan.

c.Titrasi

            Sesudah cairan yang menempel pada alat disemprot dengan akuades, larutan asam penangkap dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N. Volum larutan NaOH yang diperlukan dicatat. 

VI.   Hasil Analisis

            Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, diperoleh data yang berupa volume larutan NaOH 0,1 N yang dibutuhkan untuk menetralkan kelebihan larutan HCl Penangkap.

            Jika digunakan V_A ml larutan HCl penangkap dengan normalitas N_A grek/L dan untuk titrasi digunakan larutan NaOH N_B yang mrencapai titik ekivalen pada volum V_B ml maka:

Jumlah larutan HCl penangkap mula-mula               = (V_A.N_A) mgrek

Sisa larutan HCl penangkap setelah distilasi selesai = (V_B.N_B) mgrek

Data yang diperoleh dari hasil percobaan

Jenis bahan yang didistlasi    = Kedelai

Berat cuplikan sampel           = 1,5002 gr

Data titrasi

v  Asam penangkap (larutan HCl)

Normalitas (mgrek/ml)     = 0,1 N

Volume                             = 132 ml

a.    Analisis cuplikan          = 57 ml

b.   Anlisis blanko               = 57,5 ml

v  Basa penitrasi (larutan NaOH)

                     Normalitas (mgrek/ml)      = 0,1 N

Volume                             = 25 ml

a.    Analisis cuplikan         = 9,8 ml

b.   Anlisis blanko             = 82,5 ml

v  Kadar protein dalam bahan dihitung sebagai berikut :

2 NaOH + (NH₄)₂SO₄                      2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O

NH_{3 +} HCl             NH₄Cl

mgrek HCl      = V_A. N_A

                        = 57,5 x 0,1

                        = 5,75 mgrek

mgrek NaOH  = V_B.N_B

                        = 82,5 x 0,1

                        = 8,25 mgrek

mgrek NH₃     = V_B.N_B

                                = 9,8 x 0,1

                        = 0,98 mgrek

Jumlah mgrek N total = jumlah mgrek NH₃ hasil distilasi

                                   = (V_A.N_A – V_B.N_B) mgrek

                                   = ( 5,75 – 0,98 ) mgrek

                                   = 4,77 mgrek

Berat N total dalam bahan (mg) = (V_A.N_A – V_B.N_B) . (Berat atom N)

                                                                        = 4,77 x 14

                                                                        = 66,78 mg

Wp  = berat N total (mg) x F     gram protein

                                                  Gram N total

        = 66,78 x 6,25

        = 417,375 mg  = 0,417375 gram

P    =  X 100 %

=  X 100 %

= 27,82 %

Maka diperoleh berat cuplikan yang dianalsis adalah W mg maka kadar protein dalam bahan itu (dalam % berat) adalah 27,82%

VII.    HASIL DAN PENGAMATAN

1.                Destruksi

Pada awal proses destruksi yang dilakukkan adalah memasukkan semua bahan  kedalam labu Kjehdahl lalu dipanaskan dengan kompor listrik dalam lemari asam, pemanas dilakukan membutuhkan waktu yang cukup lama sehingga waktu diperhitungkan selama + 04.54 menit hingga kabut dalam labu hilang menimbulkan terjadinya letupan-letupan dikarenakan tekanan uap yang tinggi. Perubahan warna didalam larutan awalnya berawarna bening dengan menambahkan bahan-bahan yang diuji menjadi warna kuning bening Setelah beberapa lama cairan yang dipanaskan dengan pemanas mantel berwarna hijau bening. Dan setelah itu proses pemanasan berlangsung sampai warna menjadi jernih dan dinginkan.

2.                Destilasi

Dari hasil percobaan yang dilakukan diperoleh hasil pengamatan yaitu setelah penambahan 2 butir Zn, 100 ml aquades serta indikator PP 5 tetes  pada labu Kjehdahl hasil destruksi serta NaOH 40 % akan diperoleh warna menjadi ungu kebiru-biruan yang mengendap dibawah. Setelah itu di destilasi,  hingga diperoleh warna akhir destilasi yaitu warna coklat. Tanda akhir jika destilasi dianggap selesai adalah adanya hentakan dalam labu.

3.                Titrasi

                    Hasil distilasi dipipet sebanyak 75 ml larutan HCl ditambahkan indikator MO sebanyak 4-5 tetes dan dititrasi dengan larutan NaOH sehingga perubahan warna yang terjadi adalah orange. Titrasi berakhir ditandai dengan warna larutan menjadi bening.